1 細(xì)胞的復(fù)蘇

【概述】

復(fù)蘇細(xì)胞要求快速融化的手段，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化。避免 由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損害。

【用品】 培養(yǎng)液、吸管、離心管、培養(yǎng)瓶

【步驟】

[1] 打開水浴鍋，將溫度調(diào)至 37 ℃；

[2] 從液氮中取出凍存的細(xì)胞株，用鑷子夾住凍存管（戴防護(hù)面罩），迅速置入 37 ℃的 水浴鍋中，不斷振搖凍存管，使之盡快融化，要在 1-2 min 內(nèi)完成復(fù)溫；

[3] *融化后，取出凍存管，移至超凈工作臺，用 75%酒精擦洗消毒，用無菌吸管吸取 細(xì)胞懸液移至無菌離心管，加 10 倍的含 10%胎牛血清的培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹勻；

[4] 細(xì)胞懸液離心，1000rpm，5-8min，小心棄上清液。加入適量含 10%胎牛血清的培養(yǎng) 液，接種于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃、5% CO2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng)；

[5] 次日更換培養(yǎng)基，以后按常規(guī)培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。如果復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞密度較高及時(shí)傳代。 細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞密度以 5×105 個(gè)/ml。

2 細(xì)胞的傳代

【概述】 培養(yǎng)細(xì)胞傳代根據(jù)不同的細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代；部分貼 壁生長但粘附不牢固的細(xì)胞也可以用直接吹打傳代；懸浮生長的細(xì)胞可以采用直接吹打或離 心沉淀后再分離傳代，或直接用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。

【用品】 PBS（或 Hanks 液）、0.25%胰蛋白酶（或含 EDTA）、培養(yǎng)液、吸管、培養(yǎng)瓶

【步驟】 貼壁細(xì)胞消化傳代法：

[1] 用無菌吸管吸棄瓶內(nèi)舊的培養(yǎng)基；

[2] 用 PBS 洗二遍，以防止殘留培養(yǎng)液中的血清對胰蛋白酶的抑制作用，向瓶內(nèi)加入 0.5--0.8 ml 胰蛋白酶（以 25cm2），輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶流遍所有的細(xì)胞表面； 加入的消化液適量，因?yàn)橄哼^多對細(xì)胞有損傷，同時(shí)也需要較多的含血清培養(yǎng)液 去中和；

[3] 消化最好在 37℃培養(yǎng)箱或室溫 25℃以上的環(huán)境下進(jìn)行消化，消化 2--5 min 后，把培 養(yǎng)瓶放在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變圓后，立即將培養(yǎng)瓶 立起并加入少許含血清的培養(yǎng)液，終止消化；

[4] 用無菌吸管反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，吹打過程按順序進(jìn)行，從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一 邊結(jié)束，以確保所有底部都被吹打到；吹打過程中動作要輕柔，盡可能不要出現(xiàn)泡沫， 這些都損傷細(xì)胞；

[5] 加入新鮮含 10%胎牛血清的培養(yǎng)液，然后將原培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液吸出，分別接種在 新的培養(yǎng)瓶中。 懸浮細(xì)胞的傳代：因?yàn)閼腋∩L細(xì)胞不貼壁，故傳代時(shí)不用采用消化法，可直接傳代或 離心收集細(xì)胞后傳代。直接傳代即讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清洗掉 1/2—2/3，然 后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后，再傳代。 懸浮細(xì)胞多采用離心方法傳代，即將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，離心 800—1000r/min，5min，然后去除上清，加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打使之形成細(xì) 胞懸液，然后傳代接種。 部分貼壁生長的細(xì)胞，不經(jīng)消化處理直接吹打也可使細(xì)胞從壁上脫落下來，而進(jìn)行傳代。 但這種方法僅限于部分貼壁不牢的細(xì)胞，如 Hela 細(xì)胞等。直接吹打?qū)?xì)胞損傷較大，導(dǎo)致較 大數(shù)量的細(xì)胞丟失，因此絕大部分貼壁生長的細(xì)胞均需消化后，才能吹打傳代。

3 細(xì)胞的凍存

【概述】 凍存細(xì)胞時(shí)要緩慢冷凍。因?yàn)榧?xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下直接冷凍時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的 水分都會很快形成冰晶，冰晶的形成將引起一系列的不良反應(yīng)。首先細(xì)胞脫水使局部電解質(zhì) 濃度增高，pH 值改變，部分蛋白質(zhì)由于上述因素而變性，引起細(xì)胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞 內(nèi)冰晶的形成和細(xì)胞膜系統(tǒng)上蛋白質(zhì)、酶的變性，引起溶酶體膜的損傷使溶解酶釋放造成細(xì) 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)成分的破壞，線粒體腫脹、功能喪失并造成細(xì)胞能力代謝的障礙。胞膜上的類脂蛋 白復(fù)合體在冷凍中易發(fā)生破壞引起胞膜通透性的改變、使細(xì)胞內(nèi)容物喪失。細(xì)胞核內(nèi) DNA 也是冷凍時(shí)細(xì)胞易受損部分。如細(xì)胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造 成 DNA 的空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷性變化，而引起細(xì)胞的死亡。 在細(xì)胞凍存時(shí)要盡可能的均勻地減少細(xì)胞內(nèi)水分，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成是減少細(xì)胞損 傷的關(guān)鍵。目前多采用甘油或者二甲基亞砜作為保護(hù)劑。這兩種物質(zhì)在深低溫冷凍后對細(xì)胞 無明顯毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對水的通透 性；加上緩慢冷凍方法可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的 形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。

【用品】 胰酶、含血清培養(yǎng)基、DMSO（分析純）或無色新鮮甘油（667.83kPa 蒸汽高壓消毒）、 吸管、離心管、凍存管

【步驟】

[1] 用無菌吸管吸棄瓶內(nèi)舊的培養(yǎng)基；

[2] 加入少量 PBS 沖洗二遍， 用胰蛋白酶把單層細(xì)胞消化下來，依據(jù)傳代的方法把細(xì)胞 懸液收集于離心管中，離心 1000 rpm，5-8 min；

[3] 小心棄上清液，加入配置好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，然后將含有 細(xì)胞的凍存液轉(zhuǎn)移到無菌的凍存管中，每個(gè)凍存管加液 1-1.5 ml，細(xì)胞最終密度為 （5—10）×106 /ml；

[4] 凍存管封口，做好標(biāo)記，按照以下程序凍存：4℃，15min- 20 min,﹣20℃ 30min- 40 min，見細(xì)胞懸液結(jié)凍后，放入﹣80 ℃冰箱 3h 或過夜，之后置于液氮中。

【注意事項(xiàng)】

[1] 從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但最好選擇對 數(shù)生長期細(xì)胞，已經(jīng)長滿的細(xì)胞凍存復(fù)蘇后生存率很低。在凍存前一天最好換 1 次培 養(yǎng)液。

[2] 將標(biāo)記好并裝入凍存管的支架，從液氮容器口緩緩放入，按 1℃/ min 的降溫速度， 在 30-40min 時(shí)間內(nèi)使其到達(dá)液氮表面。再停 30min 后，直接投入液氮中。

[3] 細(xì)胞在凍存后要在短期內(nèi)復(fù)蘇 1 次，觀察細(xì)胞對凍存的適應(yīng)性。

4 細(xì)胞的計(jì)數(shù)

【概述】 細(xì)胞計(jì)數(shù)法是細(xì)胞培養(yǎng)研究中的一項(xiàng)基本技術(shù)，它是了解培養(yǎng)細(xì)胞生長狀態(tài)，測定培養(yǎng) 基、血清、藥物等物質(zhì)生物學(xué)作用的重要手段。常用的細(xì)胞技術(shù)有血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法和電子 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)法。

【用品】 血球計(jì)數(shù)板、吸管、胰酶、培養(yǎng)液、顯微鏡

【步驟】

[1] 準(zhǔn)備計(jì)數(shù)板：用無水乙醇或 95%乙醇清潔計(jì)數(shù)板和蓋玻片，待干燥后，把蓋玻片覆在 計(jì)數(shù)板上面，使之微微移向一側(cè)，露出計(jì)數(shù)板臺面少許；

[2] 用移液槍在計(jì)數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)胞懸液，加樣時(shí)不要溢出蓋玻片也不能溢 入兩側(cè)的玻璃槽內(nèi)，如果產(chǎn)生上述情況需對計(jì)數(shù)板沖洗和拭干后重新加樣，加樣量也 不要過少或帶氣泡；

[3] 在顯微鏡下，用 10×物鏡觀察，可見細(xì)胞均勻分散計(jì)數(shù)板各處。計(jì)算四角大方格內(nèi) 的細(xì)胞數(shù)，壓中線者只計(jì)算左線和上線者，右線和下線不計(jì)算在內(nèi)(即僅計(jì)算壓兩個(gè) 邊的細(xì)胞)，成團(tuán)細(xì)胞按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算。按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度： (細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù))/ml＝(四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4) ×稀釋倍數(shù)×104

【注意事項(xiàng)】

[1] 消化單層細(xì)胞時(shí)，務(wù)求細(xì)胞分散良好，制成單細(xì)胞懸液。否則會影響細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。

[2] 取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液。在連續(xù)取樣計(jì)數(shù)時(shí)，尤其要注意這一點(diǎn)。否則， 前后計(jì)數(shù)結(jié)果會有很大的誤差。

[3] 鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，遇見 2 個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如細(xì)胞團(tuán) 10%以 上，說明消化不充分；或細(xì)胞數(shù)少于 2 個(gè)/mm2或多于 50 個(gè)/mm2時(shí)，說明稀釋不當(dāng)， 需重新制備細(xì)胞懸液、計(jì)數(shù)。

5 培養(yǎng)細(xì)胞的運(yùn)輸

裝運(yùn)細(xì)胞的方法有兩種，一種為冷凍儲存運(yùn)輸，即利用特殊容器內(nèi)盛液氮或干冰凍存， 保存效果較好，但較麻煩，且不宜長時(shí)間運(yùn)輸，多需空運(yùn)。另一種簡單的方法為充液法，步 驟如下： [1] 選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，可直接根據(jù)路程時(shí)間來選擇接種細(xì)胞數(shù)量，一般以長滿 1/3—1/2 瓶底壁為宜，去掉舊培養(yǎng)液，補(bǔ)充新的培養(yǎng)液到達(dá)瓶頸部，保留微量空氣， 擰緊瓶蓋，瓶口用膠帶密封。 [2] 妥善包裝運(yùn)送，并用棉花等做防震防壓處理。4—5 天可以到達(dá)目的地者一般放在貼身 口袋即可，到達(dá)目的地后倒出多余的培養(yǎng)液，僅保留維持細(xì)胞生長所需液量。37℃培 養(yǎng)，次日傳代。 [3] 如果距離很近，如在統(tǒng)一城市內(nèi)或數(shù)小時(shí)路程，也可將細(xì)胞附著面朝上，或把培養(yǎng)液 全部倒掉放在胸部口袋進(jìn)行運(yùn)送。僅靠附著于細(xì)胞表面的培養(yǎng)液，可使細(xì)胞短時(shí)間不 致受損。 6 多藥耐藥細(xì)胞的培養(yǎng) 多藥耐藥（Multidrug Resistance, MDR）是指腫瘤細(xì)胞長期接觸某一化療藥物，不僅對 此種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，而且對其他結(jié)構(gòu)和功能不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性的現(xiàn) 象，是造成化療失敗的主要原因。 耐藥指數(shù)（RF）=某種藥物針對抗藥性細(xì)胞的 IC50/某種藥物針對敏感性細(xì)胞的 IC50。 逆轉(zhuǎn)指數(shù)（reverse index, RI）=不加逆轉(zhuǎn)劑時(shí)某種藥物針對抗藥性細(xì)胞的 IC50/加入逆 轉(zhuǎn)劑后某種藥物針對抗藥性細(xì)胞的 IC50。 體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對特定細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。 第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測和排除 組織培養(yǎng)細(xì)胞被有害物污染是組織培養(yǎng)工作的大敵。應(yīng)用組織培養(yǎng)進(jìn)行研究工作，除需 要好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和技術(shù)方法外，成敗的關(guān)鍵還在于能否避免污染。一項(xiàng)好的研究,或建成的滿 意細(xì)胞系，往往由于遭受污染而前功盡棄。因此，一個(gè)組織培養(yǎng)工作者,要始終注意防止污染。 培養(yǎng)細(xì)胞被污染，人們最注意的是真菌、細(xì)菌和病毒等微生物?，F(xiàn)在看來已經(jīng)不夠，當(dāng) 前“污染"一詞的概念應(yīng)該是，凡混入培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異 物，都應(yīng)視為污染。從這一概念考慮，組織培養(yǎng)污染應(yīng)包括以下幾個(gè)方面： 微生物：真菌、細(xì)菌、支原體和病毒 化學(xué)物質(zhì)：影響細(xì)胞生存的非細(xì)胞所需的化學(xué)成分 細(xì)胞：非同種的其它細(xì)胞 當(dāng)然在培養(yǎng)中以微生物污染最為多見，化學(xué)污染較少；但近年隨細(xì)胞種類增多,不同種細(xì) 胞交叉污染卻屢有發(fā)生，以致在 ATCC 接受入庫細(xì)胞中特設(shè)同工酶檢測一項(xiàng)，目的在于證明 是否有 HeLa 等細(xì)胞的交叉污染。但細(xì)胞交叉污染只要工作細(xì)心，是容易防止的，而微生物 污染在實(shí)際工作中卻是最難防止和易發(fā)生的。

1 污染途徑

各種污染主要通過以下途徑和媒介發(fā)生：

[1] 空氣

空氣是擴(kuò)散微生物的主要途徑。由于空氣流動性大，在操作場地與外界隔離不嚴(yán) 和消毒不充分的情況下，外界不潔空氣很容易侵入造成污染。因此，培養(yǎng)設(shè)施不宜置于通風(fēng) 場所。現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)室普遍應(yīng)用凈化工作臺，能產(chǎn)生無菌的屏障氣流，可防止不潔空氣污染。凈 化工作臺使用過久，過濾層受塵埃堵塞情況下，工作時(shí)不帶口罩或外界氣流過強(qiáng)、污染空氣 均可進(jìn)入操作野，導(dǎo)致污染。又不同季節(jié)和不同地區(qū)空氣內(nèi)含菌數(shù)不同；炎熱夏季尤其南方 多雨地區(qū)空氣濕度大、含菌數(shù)量多，工作應(yīng)特別注意?？諝馐遣粩嗔鲃拥?；雖用消毒措施也 難以排出空氣中所有微生物，但每立方米內(nèi)含菌數(shù)不應(yīng)超過 1--5 個(gè)。

[2] 器材

培養(yǎng)器皿和容器洗刷不凈殘留污物、培養(yǎng)用液滅菌不*等，都可引入有害物。

[3] 操作

實(shí)驗(yàn)操作馬虎、動作不準(zhǔn)確、消毒觀念不強(qiáng)，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等； 或封瓶口時(shí)不嚴(yán)，都可發(fā)生污染。同時(shí)培養(yǎng)兩種以上細(xì)胞，操作不慎，使用同一吸管或 用液，可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。

[4] 血清

血清也是污染細(xì)胞的來源，有的市售血清制備水平低、檢測不嚴(yán)，常已被支原體 和病毒污染。

[5] 組織

初代培養(yǎng)組織常有污染；有的是在手術(shù)中污染，有的本身可能是被污染的組織(如 已經(jīng)發(fā)生潰爛的腫瘤組織)；手術(shù)用碘酒消毒后，擦拭不凈可能混入碘污染。

2 污染對細(xì)胞的影響

體外培養(yǎng)細(xì)胞

[1] 細(xì)胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線菌素 D 或雙抗都于事無補(bǔ)，建議舍棄該污染細(xì)胞， 將環(huán)境*消毒。無菌室經(jīng)甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水噴灑中和，約幾小時(shí)即可進(jìn) 入操作。

[2] 細(xì)菌污染

較常見的污染細(xì)菌有大腸桿菌、假單孢菌，白色葡萄菌等。細(xì)菌污染后大多 能改變培養(yǎng)液 pH 使培養(yǎng)液變混濁，也有的對培養(yǎng)液無肉眼可見影響，只在鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菌 體時(shí)才能感知污染。細(xì)菌增殖迅速，能消耗營養(yǎng)液和產(chǎn)生毒素抑制細(xì)胞生長，毒性大的細(xì)菌 很快導(dǎo)致細(xì)胞崩解死亡。加用抗生素的培養(yǎng)用液一般可預(yù)防和排除個(gè)別少量細(xì)菌的污染。一 旦發(fā)生細(xì)菌污染很易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，出現(xiàn)明顯污濁現(xiàn)象。 細(xì)菌和霉菌污染多在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生。而且由于增生迅速，多 在發(fā)生污染 48h 以內(nèi)就已明顯。因此在實(shí)驗(yàn)的最初兩天密切觀察實(shí)驗(yàn)樣本是否有污染發(fā)生， 這樣可及時(shí)采取措施予以補(bǔ)救或排除。

[3] 支原體污染

支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見、不易被察覺和干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一種污染。從 1952--1972 年間，有人檢查了 54 個(gè)實(shí)驗(yàn)室的 9700 個(gè)各類培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，有 11%的細(xì)胞受 到了支原體的污染。當(dāng)前隨實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的改善和技術(shù)方法的改進(jìn)，支原體污染率有所下降， 但尚未能*杜絕，污染仍時(shí)有發(fā)生。支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)研究室重點(diǎn)預(yù)防對象。 支原體是一種介于細(xì)菌和病毒之間的目前所知能獨(dú)立生活的最小微生物，它無細(xì)胞壁， 形態(tài)呈高度多樣性，最小的直徑 0.2 微米，可通過濾菌器。支原體大小介于 0.2～2 微米之間， 約有 1%可通過濾菌器，因此往往難以發(fā)現(xiàn)。支原體形態(tài)多變，有圓形、絲狀或梨形：光鏡下 難以看清其結(jié)構(gòu)。支原體多吸附于細(xì)胞表面或散在細(xì)胞之間，橫斷面很像細(xì)胞微絨毛的橫斷 面。 不同支原體的生物學(xué)性狀有很大差別。所有支原體都需要固醇，部分需要精氨酸，有的 需氧、葡萄糖，有的有 DNA 酶活性、溶血作用和凝集作用;有的缺乏或全無某一特性，因此 支原體對培養(yǎng)細(xì)胞的影響是多方面的。大多數(shù)支原體適于偏堿條件下生存(pH7.6--8.0)，對酸 耐受性差，對熱比較敏感;對青霉素普遍有抗藥性；青霉素作用主要抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成， 支原體無細(xì)胞壁，故不受影響。細(xì)胞受支原體污染后，個(gè)別嚴(yán)重情況下，加之細(xì)胞敏感，可 使細(xì)胞增殖緩慢、部分細(xì)胞變圓、從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞受污染后，無明顯變化，或有微 細(xì)變化卻由于傳代和換液而被緩解。在觀察不夠細(xì)心和缺乏經(jīng)驗(yàn)時(shí)，外觀上往往給人以“正常" 的感覺，實(shí)則污染細(xì)胞會受到多方面潛在的影響。

[4] 細(xì)胞交叉污染

細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞間交叉污染并不罕見，多是由于在培養(yǎng)操作過程中各 種細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行，混雜使用所用器具或液體所致，這種污染能使細(xì)胞的生長特性、形態(tài)特征 等發(fā)生變化，有些變化較輕微、不易察覺，有些則可能由于污染的細(xì)胞具有生長優(yōu)勢最終壓 過原來細(xì)胞而導(dǎo)致細(xì)胞的生長抑制，最終死亡。常用觀察細(xì)胞形態(tài)、分析生長特性和核型、 檢測細(xì)胞的標(biāo)記物等方法檢測交叉污染的細(xì)胞。

3 污染的檢測

[1] 細(xì)菌、真菌污染的檢測

肉眼觀察 細(xì)菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且增生迅 速，若有污染，在 48 小時(shí)內(nèi)可明顯觀察到，例如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂 起。 接種觀察 采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。 鏡下觀察 在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細(xì)菌污 染。 若細(xì)胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。

[2] 支原體污染的檢測

相差顯微鏡觀察 直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察，支原體在鏡下呈 暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間，有時(shí)可見類似于布朗運(yùn)動的表現(xiàn)。應(yīng)注意與細(xì)胞破 碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。 熒光染色法觀察 用熒光染料 Hoechst33258，此染料能與 DNA 特異地結(jié)合，可使支原 體內(nèi)的 DNA 著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn)，散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面。 電鏡檢測 若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細(xì)胞培養(yǎng) 48～72 小時(shí)， 細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。 培養(yǎng)檢測 將細(xì)胞懸液 5mL 加入 45mL 支原體肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng) 14 天后觀察肉湯培養(yǎng) 有無霧狀沉淀，然后取 0.5ml 加入已冷卻到 50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)， 37℃培養(yǎng) 3 天觀察有無“荷包蛋"菌落出現(xiàn)。

[3] 病毒的檢測

應(yīng)用電鏡技術(shù)快速診斷動物病毒病。 逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng) RT-PCR 檢測病毒。

4 污染的預(yù)防

防止污染，預(yù)防是關(guān)鍵，預(yù)防措施應(yīng)貫穿于整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的始終。培養(yǎng)細(xì)胞 的污染一旦明確，多數(shù)將無法救治，如果污染的細(xì)胞不是具有重要的價(jià)值，一般發(fā)現(xiàn)污染后 應(yīng)盡快棄之，以防污染擴(kuò)大影響其他細(xì)胞。因此，應(yīng)盡力預(yù)防污染的發(fā)生。防止的關(guān)鍵在嚴(yán) 格無菌操作，把好每一關(guān)口，盡可能禁止其他污染的物品進(jìn)入培養(yǎng)操作環(huán)節(jié)。

[1] 器皿準(zhǔn)備中的預(yù)防

用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿應(yīng)嚴(yán)格清洗，做到真正潔凈；應(yīng)該無菌的物品， 要做到消毒嚴(yán)格，真正無菌；器皿在運(yùn)輸、貯藏過程中，要嚴(yán)格操作，謹(jǐn)防污染。

[2] 開始操作前的預(yù)防

主要包括以下方面：應(yīng)當(dāng)按廠家規(guī)定，定期清洗或更換超凈工作臺 的空氣濾網(wǎng)，請專職人員定期檢查超凈工作臺的空氣凈化標(biāo)準(zhǔn)；檢查培養(yǎng)器皿是否有消毒標(biāo) 志，有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡可能使用一次性無菌器皿；檢查新配制的培養(yǎng)液，確認(rèn)無菌方可應(yīng) 用；操作前提前半小時(shí)啟動超凈工作臺及紫外消毒燈；操作者應(yīng)消毒雙手和戴口罩。

[3] 操作過程中的預(yù)防

主要包括：在超凈工作臺面放置的所有培養(yǎng)瓶瓶口不能與超凈工作 臺的風(fēng)向相逆，不允許用手觸及器皿的無菌部分，如瓶口和瓶塞內(nèi)側(cè)；在安裝吸管帽、開啟 或封閉瓶口操作時(shí)要經(jīng)過火焰燒灼，并在火焰附近工作；吸取培養(yǎng)液、細(xì)胞懸液等液體時(shí)， 應(yīng)專管專用，防止污染擴(kuò)大或造成培養(yǎng)物之間的交叉污染；使用培養(yǎng)液前，不宜過早開瓶； 開瓶后的培養(yǎng)液應(yīng)保持斜位，避免直立；不再使用的培養(yǎng)液應(yīng)立即封閉瓶口；培養(yǎng)的細(xì)胞在 處理之前勿過早暴露于空氣中；操作時(shí)不要交談、咳嗽，以防唾沫和呼出氣流引發(fā)污染；操 作完畢后應(yīng)將工作面整理好，并消毒擦拭工作面，關(guān)閉超凈工作臺。

[4] 其他方面的預(yù)防

主要有：為了確保培養(yǎng)物的安全，應(yīng)及早凍存有價(jià)值的培養(yǎng)物；購入 的未滅活血清應(yīng)采取 56℃水浴滅活 30 分鐘的措施以使血清中的補(bǔ)體和支原體滅活；對新引 進(jìn)的細(xì)胞株應(yīng)加強(qiáng)觀察，防止外來的污染源；超凈臺的風(fēng)機(jī)不能過大，風(fēng)機(jī)到 6-8 格。否則 也可能能致霉菌污染；孵箱應(yīng)定期清潔（2 月左右），尤其在多雨的季節(jié)，培養(yǎng)箱清洗方法是： 用 84 液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外燈照。定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用 自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用 3‰來蘇爾或者新潔爾滅或者 0.5％過氧乙酸擦 拭。

5 污染的排除

培養(yǎng)的細(xì)胞一旦被微生物污染，應(yīng)及時(shí)處理，防止其他細(xì)胞被污染。通常選 高壓滅菌被污染的細(xì)胞，然后棄掉。如果有價(jià)值的細(xì)胞被污染，并且污染程度比較輕，可通 過及時(shí)排除污染物，挽救細(xì)胞恢復(fù)正常。常用的排除微生物污染方法有如下幾種：

[1] 抗生素排除法

抗生素是細(xì)胞培養(yǎng)中殺滅微生物的主要手段。各種抗生素性質(zhì)不同，對 各種微生物的作用也不同，聯(lián)合應(yīng)用比單用效果好，預(yù)防性應(yīng)用比污染后使用好；如果發(fā)生 微生物污染后再使用抗生素，常難以*。有的抗生素對細(xì)菌僅有抑制作用，而無殺滅效應(yīng)。 反復(fù)使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，且對細(xì)胞本身也有一定影響，因此有人主張盡量 不用抗生素處理，當(dāng)然，一些有價(jià)值的細(xì)胞被污染后，仍需用抗生素挽救，在這種情況下， 可采用 5～10 倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用 24--48 小時(shí)，再換入常規(guī)培養(yǎng) 液。有時(shí)可能奏效。抗生素的參考用量和效果列于表。 表 常用抗生素及推薦用量 抗生素 抗菌譜 常用濃度 細(xì)菌 真菌 支原體 青霉素 鏈霉素 慶大霉素 四環(huán)素 卡那霉素 兩性霉素 制霉菌素 G+ GG+/GG+/GG+/G- + + + + + 100IU/ml 100μg/ml 200μg/ml 10μg/ml 50μg/ml 2μg/ml 25μg/ml

[2] 加溫除菌

根據(jù)支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。有人將受支原體污染的細(xì)胞置于 41℃中作用 5～10 小時(shí)(最長可達(dá) 18 小時(shí))以殺滅支原體。但 41℃對培養(yǎng)細(xì)胞本身也有較大影響，故在處 理前，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定出最大限度殺傷支原體而對細(xì)胞影響較小的處理時(shí)間。

[3] 動物體內(nèi)接種

受微生物污染的腫瘤細(xì)胞可接種在同種動物皮下或腹腔，借動物體內(nèi)免 疫系統(tǒng)消滅污染的微生物，腫瘤細(xì)胞卻能在體內(nèi)繼續(xù)生長，待一定時(shí)間后，從體內(nèi)取出再進(jìn) 行培養(yǎng)繁殖。

[4] 與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)

在良好的體外培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞可存活 7--10 天，并可分泌一些細(xì) 胞生長因子支持其他細(xì)胞的克隆生長。與體內(nèi)的情況相似，巨噬細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下仍然 可吞噬微生物并將其消化。利用 96 孔培養(yǎng)板將極少量的培養(yǎng)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，可以在 高度稀釋培養(yǎng)細(xì)胞、極大地降低微生物污染程度的同時(shí)，更有效地發(fā)揮巨噬細(xì)胞清除污染的 效能。本方法與抗生素聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。

主要參考文獻(xiàn)：

[1] 薛慶善主編.體外培養(yǎng)的原理與技術(shù).北京:科學(xué)出版社,2001

[2] 陳瑞銘主編，動物組織培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用.第二版.北京：科學(xué)出版社，1998

[3] 鄂征主編.組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù).第二版.北京：北京出版社，1997

[4] 薛慶善主編.體外培養(yǎng)的原理與技術(shù).北京：科學(xué)出版社，2001

[5] 章靜波主編，組織和細(xì)胞培養(yǎng)技.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002

[6] 張卓然主編，實(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù).北京：人民衛(wèi)生出版社，1999 附：

主要試劑的配制

[1] McCoy’s 5a 培養(yǎng)基 配制 1000 ml 培養(yǎng)基：稱取青霉素 0.08g，鏈霉素 0.1g，NaHCO31.5 g，Hepes2.38g 和 McCoy’s 5a 干粉一袋，放入已消毒的 1000ml 燒杯中，加適量超純水，充分?jǐn)嚢枞芙?，混?定容至 1000 ml, 在超凈臺中用 0.22 µm 微孔濾膜的過濾除菌，4 ℃保存。

[2] 胰蛋白酶(trypsin) 液(0.25%) 精密稱取胰蛋白酶 0.25 g，溶于 100 ml PBS 緩沖液中，用 0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌， 小瓶分裝，4 ℃保存。

[3] 細(xì)胞凍存培養(yǎng)液(含 10%二甲基亞砜) 配制 10 ml 細(xì)胞凍存液：取 9 ml 胎牛血清于無菌離心管中，加入 1 ml 二甲基亞砜，混勻， 4℃保存。

[4] 磷酸鹽緩沖液(PBS) 稱取 NaCl 8.5 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 ·12H2O 2.85 g、KH2PO4 0.27 g，在 1000 ml 超純水 中溶解，于高壓滅菌器中 121℃滅菌 25 min，4 ℃保存。